Riccardo Sgarra, docente

Sarà molto probabile che nelle le vostre esperienze di laboratorio veniate a contatto con degli agenti biologici. Che cos’è un agente biologico? È un qualsiasi microrganismo, anche se geneticamente modificato, colture cellulari e endoparassita, che potrebbe provocare infezioni , allergie e intossicazioni.

Per microrganismo si intende qualsiasi entità microbiologica cellulare o meno in grado di riprodursi e trasferire del materiale genetico. Sarà comune che voi manipoliate delle colture cellulari, dove per colture cellulari si intende il risultato della crescita in vitro di cellule derivate da organismi pluricellulari. È comune ad esempio la manipolazione di cellule di origine umana per effettuare diversi tipi di esperimenti. Tutti questi agenti biologici sono classificati in base al rischio che comportano per l’operatore e la comunità e i gruppi in cui sono suddivisi sono quattro: gruppo 1, gruppo2, gruppo 3, gruppo 4.

Gli agenti biologici sono divisi in quattro gruppi: gruppo 1 gruppo 2 gruppo 3 e gruppo 4. Sostanzialmente la grossa differenza risiede tra gruppo 1 e gruppo 2 e tra gruppo 3 e gruppo 4. Il gruppo 1 sostanzialmente sono agenti biologici che non presentano grossi rischi in quanto non danno insorgenza a malattie nell’uomo, il gruppo 2 invece può dare luogo a malattie in soggetti umani ma si tratta di malattie per le quali sono attualmente disponibili degli efficienti sistemi di profilassi e delle terapie. Per intendersi chi maneggia il virus influenzale maneggia un agente biologici di tipo 2. Chi maneggia virus che danno origine alle varie malattie esantematiche maneggia agenti biologici di tipo 2. Diversamente è chi si occupa di agenti che ricadono nelle categorie 3 e 4.

Per quanto riguarda invece gli agenti biologici che ricadono nei gruppi 3 e 4. questi sono agenti biologici che possono dare gravi malattie nei soggetti umani. Per quanto concerne il gruppo 3 anche se danno origine a gravi malattie di solito sono presenti dei sistemi di profilassi ed eventuali terapie. In questa categoria può essere incluso ad esempio il virus dell’epatite B e ed entro certi limiti anche il virus HIV. Per quanto riguarda invece il gruppo 4 si tratta di agenti biologici che provocano gravi malattie per i quali non sono ancora disponibili sistemi di profilassi e terapie efficaci, caso molto attuale è ad esempio il caso del virus Ebola.

Diretta conseguenza del fatto che esistono più categorie di agenti biologici a rischio crescente c’è il fatto che anche le strutture nelle quali devono essere o possono essere manipolati questi agenti devono rispettare livelli di contenimento e di sicurezza via via crescenti ed infatti si possono individuare quattro livelli di contenimento. Che cos’è un livello di contenimento? Un livello di contenimento è un insieme di norme, procedure e spazi fisici che prevengono il diffondersi dell’agente biologico al di fuori del laboratorio dove lo si maneggia. Ci sono livelli di contenimento cosiddetti primari che proteggono l’operatore dall’esposizione all’agente biologico e ci sono livelli di contenimento secondari che prevengono il diffondersi dell’agente biologico al di fuori del laboratorio stesso. Per intenderci tutti i dispositivi di protezione individuali(camice, occhiali) e le cappe biologiche possono essere intesi come dispositivi di contenimento primari mentre per quanto concerne i dispositivi di contenimento secondari ad esempio i laboratori devono essere in un ambiente depressurizzato ovvero in pressione negativa ovvero che l’aria non possa espandersi al difuori del laboratorio. I laboratori devono avere un sistema di ricircolo dell’aria con dei filtri atti a contenere l’eventuale agente biologico che venga all’essere immesso nell’aria dei laboratori. I laboratorio di solito sono isolati, a doppia porta, nel senso che vengono isolati dal resto della struttura. Insomma ci sono una serie di accorgimenti che fanno sì che il rischio sia ridotto al minimo oppure addirittura a zero.

Per la manipolazione dei vari agenti biologici è necessario avere a disposizione un laboratorio che sia classificato di tipo 1, 2, 3 e 4 a seconda dell’agente biologico usato. Questi laboratori si caratterizzano per la presenza di barriere primarie e secondarie via via ad efficacia crescente che rappresentano quindi degli elementi di sicurezza fondamentali. Ad esempio i laboratori per la manipolazione di agenti biologici di tipo 1 richiedono come barriera secondaria semplicemente un lavandino da usare quando si esce dopo aver manipolato degli agenti biologici che in questo caso qui non presentano alcun rischio. Quando invece ad esempio dobbiamo maneggiare agenti biologici di tipo 2 dove è presente un rischio una barriera secondaria che deve essere presente nel laboratori oltre al lavandino è un sistema per la disinfezione ovvero la disinfezione del materiale di risulta dalle manipolazione dell’agente biologico come ad esempio un autoclave per la sterilizzazione del materiale. Aumentando il livello del laboratorio e passiamo a laboratorio di livello 3 o livello 4 devono essere presenti degli ulteriori sistemi di sicurezza come ad esempio la doppia entrata, il sistema di depressurizzazione  dell’ambiente, i filtri dell’aria in uscita fino ad arrivare addirittura alla separazione fisica del laboratorio dove ad esempio si devono maneggiare degli agenti biologici di tipo 4. Una considerazione che è opportuno fare: al 2014 nell’Università di Trieste ad esempio non vengono maneggiati agenti biologici che appartengono ai gruppi 3 o 4 in quanto sono presenti solo ed esclusivamente laboratori di tipo 1 o 2.

Uno dei dispositivi di prevenzione collettiva più largamente diffusi in un laboratorio per la manipolazione di agenti biologici è la cappa. Di cappe ne esistono di diversi tipi, che offrono meno protezione all’operatore e anche agli agenti biologici che uno sta maneggiando, perchè non dimentichiamoci che in molti casi la cappa serve sì per proteggere l’operatore ma serve anche per prevenire delle contaminazioni del materiale biologico che uno sta manipolando. Le cappe a flusso laminare orizzontale sono della cappe molto diffuse in laboratorio ma sono delle cappe che non offrono protezione all’operatore, servono semplicemente per mantenere la sterilità nella preparazione di materiale da utilizzare con i vari agenti biologici. Invece per quanto riguarda le cappe a flusso laminare verticale queste offrono una protezione all’operatore e una protezione al materiale biologico che si sta manipolando, ne esistono di tre tipi: classe 1, classe 2 e classe 3. La classe 1 è semplicemente una cappa che protegge l’operatore in quanto non permette all’aria, all’atmosfera che è presente nella cappa di uscire dalla cappa stessa e tutta l’aria in uscita viene filtrata da un filtro HEPA. Per quanto invece riguarda le cappe di classe 2 queste offrono sia una protezione all’operatore in quanto l’aria, l’ambiente, l’atmosfera sotto cappa, non può uscire dalla cappa stessa e in uscita è filtrata ma anche l’aria che entra nella cappa prima di arrivare a contatto con gli agenti biologici che si sta maneggiando sotto cappa è filtrata. In questo modo oltre che l’operatore è protetti anche gli agenti biologici classici esempi colture cellulari che sono facilmente soggette a contaminazione batterica o da muffe che devono essere protette da queste particolare cappe di classe 2. Esiste ancora una cappa ad un livello di protezione crescente le cappe di classe 3 che sono anche comunemente definite Glove-box ovvero sono delle cappe dove c’è separazione fisica fra il materiale in esse contenute e l’operatore agisce sull’agente biologico, sul materiale che è contenuto sotto cappa, attraverso dei guanti che appunto lo dividono fisicamente dall’egente biologico.

Le cappe di classe 3 sono preposte alla manipolazione di agenti biologici che appartengono al gruppo 4 quindi sono agenti biologici ad elevato rischio pertanto anche le procedure che sono preposte all’introduzione del campione nella cappa e al recupero del campione biologico devono essere molto controllate per evitare il rischi di contaminazione durante queste fasi. Quindi è previsto un passaggio in una camera intermedia dove il campione viene introdotto in contenitori, che sono isolanti per quanto riguarda l’agente biologico, anche il momento del recupero il campione biologico deve essere riposto in questi contenitori e il contenitore deve essere in qualche modo sterilizzato, solo in questo momento può essere portato nell’ambiente esterno.

Quando si entra in una stanza per le colture cellulari you bisogna essere certi di conoscere le corrette procedure per l’utilizzo di tutte le strumentazioni, in che in esse sono contenute. In particolar modo, la cappa biologica è uno strumento fondamentale per eseguire tutte le operazioni in sicurezza. Quando si lavora sotto cappa, you bisogna accertarsi che la cappa sia perfettamente funzionante, che sia stata attivata e di mantenere le condizioni di sterilità durante il suo utilizzo. Uno dei problemi ad esempio, è quello di aprire la cappa quando ancora non è stato attivato il flusso laminare. Questo impedisce di mantenere all’interno della cappa le condizioni di sterilità necessarie per eseguire tutte le operazioni con le colture cellulari.

In effetti, un utilizzo corretto della cappa prevede che, nel momento in cui si entra in laboratorio e si comincia a lavorare, la cappa deve essere correttamente avviata secondo le procedure che sono riportate sul manuale di istruzioni, e in particolar modo che la cappa sia preventivamente sterilizzata mediante l’utilizzo di una lampada UV, per far sì che siano mantenute all’interno delle condizioni di sterilità. Un’altra cosa che è fondamentale, è quella di accertarsi che la cappa sia attiva, ad esempio bisogna controllare che il flusso funzioni. Quando si lavora sotto la cappa, è opportuno che anche l’operatore stesso sia pulito: quindi che indossi degli abiti puliti, che indossi dei guanti per non contaminare ciò che all’interno della cappa è stato deposto e che gli stessi guanti siano stati lavati, anche con alcool. L’operatore non deve toccare gli oggetti all’esterno della cappa e deve evitare di entrare nella cappa senza guanti opportunamente puliti. Questo sempre per far sì che le condizioni della cappa siano mantenute in condizioni appunto di sterilità. Un’altra cosa che capita e si vede comunemente in tanti laboratori, è il disordine che è presente sotto la cappa. Bisogna ricordarsi che la cappa biologica non è assolutamente un deposito, ma è un ambiente in cui si devono eseguire determinate e specifiche operazioni. E quindi la cappa deve essere mantenuta il più possibile sgombra da tutte le cose che non sono assolutamente necessarie ad eseguire le operazioni che uno andrà ad effettuare in quel momento.

La cappa è un ambiente in cui si lavora in condizioni di sterilità e pertanto you bisogna fare in modo che essa sia mantenuta sempre pulita e bisogna evitare sversamenti, bisogna evitare di lasciare puntali e oggetti sul piano di lavoro, e nel caso uno abbia causato uno sversamento, ad un rovesciamento di liquidi o altre cose, è opportuno che si proceda ad una pulizia del piano di lavoro. Di solito la pulizia del ripiano di lavoro, viene effettuata con una soluzione a base di etanolo per mantenere appunto la sterilità del piano di lavoro stesso.

È importante che gli oggetti che sono stati riposti all’interno della cappa, siano mantenuti anch’essi in condizioni di sterilità, pertanto essi devono essere aperti solo ed esclusivamente all’interno della cappa stessa e mi riferisco in particolar modo alle falcon o ad esempio alle buste che contengono le pipette, il cui interno è stato opportunamente sterilizzato. You bisogna fare anche molta attenzione nel far sì che le pipette o le superfici interne delle falcon non vengano a contatto con superfici che erano state precedentemente esposte al contatto con un ambiente non sterile, ad esempio lo stesso cassetto dove erano state contenute. Ecco il perché quando si lavora sotto cappa you bisogna far sì che venga mantenuto un opportuno controllo di tutte le operazioni manuali che vengono effettuate e bisogna essere molto critici nel valutare se si sta compiendo un gesto che possa in qualche modo precludere la condizione di sterilità e quindi è sempre meglio operare con molta, molta, molta calma.

Bisogna quindi evitare di lavorare sotto cappa senza indossare l’opportuno lab camice che deve essere un camice dedicato a questo tipo di attività, senza indossare dei guanti che siano puliti o che non siano stati in contatto con superfici esterne. Bisogna anche evitare, ad esempio, di lavorare con i capelli down, che potrebbero entrare nella cappa e portare una contaminazione al suo interno. Bisogna sempre ricordare che voi siete l’ambiente esterno che entra in un ambiente sterile e quindi siete fonte di contaminazione all’interno di una cappa biologica. E questo deve essere ben chiaro e deve guidare i vostri movimenti all’interno della cappa, in modo da evitare ogni tipo di contatto non appropriato con il materiale con il quale verranno a contatto ad esempio le cellule che voi state coltivando sotto cappa.

un aneddoto

«Un altro accident invece che mi è successo personalmente è stato praticamente uno sversamento di azoto liquido direttamente addosso a me quando stavamo frantumando tessuti  a temperature molto basse. L’azoto liquido arriva a – 170°C, mi sembra, e una mia collega stava versando nel contenitore questo azoto e io was grinding, ma she ha sbagliato la mira e quindi l’azoto è arrivato sopra di me, sulle mie gambe. Per fortuna usavo il lab camice che mi ha protetto.»

Quando state lavorando sotto una cappa biologica, dovete ricordare anche un’altra cosa, cioè quella di non contaminare anche voi stessi con il materiale con cui state lavorando, che potrebbe eventualmente comportare dei rischi per la vostra salute. Mi riferisco in particolar modo, a tutti quei possibili contatti che voi potreste avere con del materiale che utilizzate normalmente, comunemente nella vostra vita, come ad esempio il cellulare, come ad esempio il pacchetto di chewingum che vi portate dietro durante la giornata. È assolutamente da evitare di laeve da una cappa biologica con dei guanti che potrebbero essere contaminati, girarsi, rispondere al cellulare, o mangiare un frutto o prendere una gomma dalla scatolina che avete sul work bench. Questo perché? Perché voi porterete indietro a casa quelli stessi oggetti, o nell’ufficio o da altre parti e essi potrebbero portare con loro le contaminazioni che voi avete arrecato su di essi.

Quando si lavora sotto cappa, molto spesso you utilizzano delle siringhe. Bisogna prestare estrema attenzione a non pungersi con una siringa, che è stata a contatto con del materiale biologico, e soprattutto you bisogna fare molta attenzione a smaltire le siringhe negli appositi contenitori rigidi che prevengono gli operatori che sono preposti allo smaltimento di questa attrezzatura, dal pungersi.

Bisogna smaltire le siringhe in appositi contenitori rigidi, perchè, se ciò non viene fatto, le siringhe potrebbero essere gettate in comuni contenitori esponendo le persone che sono preposte allo smaltimento delle immondizie al rischio di pungersi con gli aghi che eventualmente possono fuoriuscire dai sacchi di plastica. Infatti, potete vedere come una siringa gettata in un contenitore not adeguato, possa rappresentare un rischio.

Tutto materiale, che viene utilizzato sotto cappa e che viene a contatto con del materiale biologico, deve essere opportunamente smaltito. Questo vale per le siringhe, questo vale per le punte, questo vale per i piatti, questo vale anche per gli stessi guanti dell’operatore, che devono essere tolti in modo da non  contaminarsi e che devono essere opportunamente smaltiti negli appropriate cestini.

Esiste una corretta procedura anche per la rimozione dei guanti, che devono essere turned su se stessi in modo che l’operatore non vada mai a contatto con la parte esterna del guanto. Anche in questo caso un comune errore è quello di non gettare i guanti negli appositi contenitori, bensì in cestini per i rifiuti ordinari. Questa è assolutamente una cosa da evitare, che espone ad un rischio biologico le persone che saranno preposte allo smaltimento dei rifiuti. Tutto il materiale che viene utilizzato sotto cappa e che viene a contatto con del materiale biologico, deve essere opportunamente smaltito in contenitori opportunamente identificati per il contenimento di materiale biologico. Anche in questo caso un comune errore è quello di gettare le punte delle pipette nei rifiuti comuni. Anche in questo caso si espone le persone che sono preposte allo smaltimento dei rifiuti ordinari, ad un possibile rischio biologico.

Tra i dispositivi di protezione individuale ci sono naturalmente i guanti. I guanti devono essere utilizzati a seconda delle dimensioni delle proprie mani, quindi devono essere utilizzati i guanti della taglia corretta. Perché questo? Un guanto di una taglia troppo piccola non è indossato correttamente, it non consente un’adeguata presa di tutto il materiale. Anche indossare un guanto troppo grande può comportare dei problemi nel maneggiare e nel manovrare i contenitori che uno va ad utilizzare.

Trascorriamo molto tempo in laboratorio e abbiamo anche dei momenti di pausa. Un errore da evitare è quello di uscire dal laboratorio e entrare nello studio o andare al proprio pc, e utilizzare questa strumentazione con addosso i guanti che avevamo in laboratorio. I guanti possono essere contaminati, e in questo modo qui noi trasmettiamo la contaminazione agli oggetti, che dopo noi utilizziamo usualmente senza questi dispositivi di protezione, esponendoci ad una possibile contaminazione.

Capita spesso che, lavorando, ci possano essere degli sversamenti. Non è un problema se vengono adottate le giuste modalità per rimediare a questo sversamento. Solitamente abbiamo a disposizione della carta per tamponare lo sversamento e la carta inquinata deve essere opportunamente smaltita nel contenitore adeguato per contenere quel tipo di sostanza. È chiaro come, nel caso di uno sversamento, indossare gli opportuni dispositivi di protezione individuale abbassi notevolmente il rischio per l’operatore. In questo caso mi riferisco proprio ai guanti che prevengono il contatto del materiale sversato con le mani o al lab camice stesso. Ricordatevi anche che qualsiasi cosa con la quale voi siete venuti in contatto in laboratorio, se in contatto con le vostre mani o anche con i vostri vestiti, voi la porterete at casa. Questa è una delle ragioni fondamentali per cui in laboratorio bisogna indossare un camice: il lab camice resta in laboratorio e in laboratorio restano anche eventuali contaminanti che non vengono a contatto direttamente con i vostri vestiti.

I work bench del laboratorio hanno un bordo alle loro estremità. Questo bordo è appositamente studiato per prevenire il fatto che un eventuale sversamento drip per terra. In laboratorio you non dovrebbero mai essere indossate delle calzature aperte, come ad esempio dei sandali. Questo perché, in caso di sversamento, c’è il rischio che il materiale sversato vada a contatto direttamente con la cute del piede. Lavorare su un work bench  con un bordo rialzato previene la possibilità che il liquido drip per terra. In laboratorio troverete anche dei work bench senza il bordo rialzato. Bene, su questi work bench, è meglio non effettuare delle operazioni di travaso di liquidi, in modo appunto da evitare un possibile sversamento di liquido a terra.

Uno strumento che viene tipicamente utilizzato in un laboratorio biologico è l’autoclave, che è uno strumento appunto che serve per sterilizzare il materiale. Bene, l’autoclave è uno strumento che raggiunge temperature elevate ed è opportuno che quando l’operatore recupera il materiale che viene sterilizzato in autoclave, egli is indossi degli opportuni guanti che prevengono eventuali scottature. In fase di sterilizzazione il materiale viene portato a temperature elevate, anche superiori ai 100 gradi centigradi, ed è quindi possibile che prendendolo a mani nude, l’operatore possa andare incontro a delle ustioni.

In precedenza vi avevo parlato della modalità corretta di smaltimento delle siringhe. Adesso volevo sottolineare un altro aspetto che riguarda l’utilizzo delle siringhe, ovvero il fatto che esse non devono mai essere incappucciate. Perché? Perché quando l’operatore  incappuccia l’ago, egli rischia di pungersi, e quindi di infettarsi, con l’ago, ed è per questa ragione che gli aghi non devono essere capped e le siringhe devono essere direttamente smaltite nell’apposito contenitore.

un aneddoto

Nella mia esperienza posso ricordare alcuni aneddoti di incidenti avvenuti in laboratorio. Quello che secondo me è stato abbastanza grave è stato l’incidente che è avvenuto ad una ragazza che stava pulendo uno strumento che è un microtomo. che serve a creare delle fette di tessuto incluso micrometriche, e quindi con una lama molto tagliente. nella pulizia, semplicemente passando un po’ di carta con alcool sulla lama, invece di passare lateralmente è passata sulla lama tagliandosi profondamente il dito.

Utilizzo di radioisotopi

Molto spesso nei laboratori biologici c’è la necessità di utilizzare  molecole radiomarcate. Questo avviene comunemente quando ad esempio si vuole verificare l’incorporazione di una modificazione post riduzionale, come la fosforizzazione sulle proteine, o quando si vuole rendere una proteina in qualche modo tracciabile , ad esempio mi riferisco alla marcatura delle proteine con lo zolfo S35, attraverso l’utilizzo di metionina radiomarcata. C’è quindi la necessità di utilizzare sostanze che sono potenzialmente pericolose per l’operatore, infatti esse sono sostanze che emettono radiazioni ionizzanti. Che cos’è una radiazione ionizzante? Sostanzialmente è una radiazione che è in grado di provocare un danno a delle molecole biologiche, si distingue ad esempio from radiazioni non ionizzanti (ad esempio la luce visibile). It è una radiazione, ma non ionizzante, non è dannosa per le molecole biologiche.

Maneggiare una sostanza radioattiva significa in primis avere a che fare con una sostanza chimica e pertanto uno deve adottare tutti i sistemi di protezione, che usa normalmente, quando opera con una qualsiasi sostanza chimica. Intendo dire guanti, lab camice, sistemi di protezione per gli occhi etc.

Quando uno maneggia una sostanza radioattiva, oltre che ad utilizzare tutti i dispositivi di protezione collettiva, come ad esempio le chemical cappe o i dispositivi di protezione individuale come i guanti ed il lab camice, deve tenere in considerazione anche il fatto di avere a che fare con  radiazioni ionizzanti, quindi deve provvedere a mascherarsi dalla loro azione. Per questo schermi in plexiglass delle dimensioni di almeno 1cm e contenitori opportuni per il contenimento delle radiomarcate sostanze chimiche  sono utilizzati. It is necessario usare sistemi per la rilevazione di eventuali contaminazioni, come ad esempio i contatori geiger. Bisogna far attenzione a lasciare l’ambiente in cui si è operato in perfette condizioni di pulizia. Ci sono detergenti appositi per la pulizia al termine delle operazioni. Oltre a maneggiare con le dovute precauzioni il materiale radioattivo, lo smaltimento dev’essere effettuato in contenitori appositi, che sono anch’essi atti a contenere e prevenire la contaminazione.

Oltre che a lavorare osservando le dovute norme di protezione, al termine degli esperimenti uno deve anche  smaltire il materiale contaminato, in opportuni contenitori. Che servono in primis a prevenire la contaminazione dell’ambiente e a prevenire anche l’esposizione dell’operatore alle radiazioni ionizzanti stesse.

A dispetto di quanto si possa credere, per sfatare dei falsi miti, i laboratori dove si maneggiano dei radionuclidi sono ambienti estremamente controllati e sicuri. Questo perché possiamo monitorare con opportuni strumenti, come ad esempio il contatore geiger, eventuali contaminazioni e provvedere in modo efficace alla rimozione di queste contaminazioni. Infatti il contatore geiger è uno strumento che ci permette di rilevare la presenza di sostanze radioattive.

In questo caso vediamo che [il contatore] sta contando delle radiazioni ionizzanti e quindi ci segnala la presenza di materiale radioattivo. Io vi faccio anche notare come utilizzare contenitori in piombo, ad esempio, porta alla completa schermatura di queste radiazioni. Vi dev’essere anche chiaro che noi possiamo monitorare se abbiamo contaminato il nostro ambiente. Sempre con l’utilizzo di questa strumentazione, di un semplice contatore geiger, noi possiamo monitorare, e lo dobbiamo fare, sia il piano di lavoro, gli schermi con i quali abbiamo lavorato, sia noi stessi, per verificare che noi non ci siamo schizzati, con il materiale, con la sostanza chimica radiomarcata. In questo modo possiamo essere certi di non aver subito una contaminazione.